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显微注射

更新时间:2015-01-13 05:15:36点击次数:866次字号:T|T
 

在高倍倒置显微镜下,利用显微操作器(Micromanipulator),控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置,用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。

操作方法

以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头(GlassNeedle,精细的玻璃微量毛细移液管)的使用,已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法,比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为---显微操作,因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置(显微操作器)以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。

分类

显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等,例如多莉羊就是运用细胞核移植技术而成功的;而转基因技术指的是将外源基因导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物的生殖细胞染色体中的一门技术,基因转殖动物被定义为由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变的动物,并可将遗传特质传递到接续的每一世代中。

应用

概述

微注射应用的范围非常广泛,从辅助(体外)细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术,比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有:各种细胞器、激酶、组织化学标志物(比如辣根过氧化物酶或者荧光黄)、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNADNA等等。运用这一技术,也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量(皮升至毫升)药剂或药物的精确输送(微灌注),例如药理学的药物检验。转基因动物的制作,可以利用基因微注射(gene microinjection)、胚干细胞(embryonic stem cells,ES cells)、精子载体(sperm vector)、反转录病毒感染(retroviral vectorinfection)及体细胞核移置(somatic cell nucleartransfer)等方法达成,其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。

显微注射

显微注射法(microinjection)是利用管尖极细(0.10.5μm)的玻璃微量注射针,将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中,然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组(rearrangement)、缺失(deletion)、复制(duplication)或易位(translocation)等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种显微注射术的程序,需有相当精密的显微操作设备,制造长管尖时,需用微量吸管拉长器(micropipettepuller),注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜,如牛、羊、猪等基因转殖动物。

优缺点

以显微注射法转外源基因没有长度上的限制,已证明数百kbDNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习,以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的,先将玻璃毛细管加热到其融化的温度,再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形,微量移液管小头的直径(小至0.2微米)与纤维操纵器的高精度相关,它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压(压力注射)或者不通过使用水流,而通过施加一电场来使带电离子运动(离子电渗法),都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。

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